酶标仪实际上就是一台变相光电比色计或分光光度计，其基本工作原理与主要结构和光电比色计基本相同。光源灯发出的光波经过滤光片或单色器变成一束单色光，进入塑料微孔极中的待测标本。该单色光一部分被标本吸收，另一部分则透过标本照射到光电检测器上，光电检测器将这一待测标本不同而强弱不同的光信号转换成相应的电信号，电信号经前置放大，对数放大，模数转换等信号处理后送入微处理器进行数据处理和计算，最后由显示器和打印机显示结果。

酶标仪滤光片应用波长100nm～400nm称为紫外光，400nm～780nm之间的光见可被人眼观察到，大于780nm称为红外光。人们之所以能够看到色彩，是因为光照射到物体上被物体反射回来。绿色植物之所以是绿色，是因为植物吸收的大部分为红橙光和蓝紫光，但对绿色不吸收，反射出来，所以植物呈现为绿色。酶标仪测定的原理是在特定波长下，检测被测物的吸光值。像492nm波长滤光片可测定酶标仪的稳定性，测定速度检定性，通过405nm、492nm、620nm波长滤光片可确定酶标仪吸光度测定的准确度等。